文 | 十一情报局
编辑 | 十一情报局
朊病毒病是一种可侵袭人类及多种动物的致死性神经退行性疾病，该疾病潜伏期较长，致死率为100%，目前并没有有效的治疗方法。
人类的朊病毒病包括克-雅病、致死性家族型失眠症、库鲁病、吉斯特曼-施特劳斯综合征等，其中以克-雅病为主。
目前根据其发病机理的不同，可将CJD分为散发型CJD、家族遗传型CJD及医源型CJD。
图 1
动物朊病毒病包括羊瘙痒症、疯牛病、骡鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病、可传播性貂脑病、猫的海绵状脑病等，在朊病毒基础研究以及临床诊断领域。
通常是运用免疫印迹以及免疫组织化学方法进行朊病毒检测。
但是这些方法敏感性较低，所以我们要探索检测朊病毒更加敏感的方法。
图 2
体外朊病毒扩增检测方法的出现，包括蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）和实时震动诱导蛋白扩增（RT-QuIC），为朊病毒的检测提供了更加快速、高灵敏度和高通量的方法。
PMCA技术是2001年Saborio等人建立的，PMCA基于一系列的周期性超声静置孵育，目的是将聚集的PrPSc分解成更小的片段，从而诱导进一步的形成聚集的PrPSc。
当组织中存在PrPSc，它将作为一个“种子”，诱导脑匀浆或细胞提取物底物中包含的PrPC转化成PrPSc，之后通过系列技术的改进，不断提高了PMCA技术的灵敏度。
图 3
2008年日本科学家建立了RT-QuIC方法，RT-QuIC采用正常重组朊蛋白（rPrPC）为底物进行间歇性震动和孵育，以启动PrPC向淀粉样纤维蛋白PrPSc的转换。
通过硫黄素T（ThT）与纤维样蛋白的结合可实时检测聚集物出现的丰度。
目前该方法已用于临床检测朊病毒以及相关疾病中错误折叠蛋白的检测，PMCA和RT-QuIC方法都能够在朊病毒病的早期无症状阶段检测到朊病毒。
本研究应用PMCA和RT-QuIC方法，以及经典的免疫印迹方法对朊病毒小鼠适应株139A、ME7和S15以及仓鼠适应株263K毒株进行检测并分析其检测能力的差异。
图4
●—≺小鼠朊病毒毒株检测分析≻—●
将上述方法中制备的小鼠朊病毒毒株139A脑组织匀浆作为初始浓度10-1g/10mL。
使用WesternBlot分别分析了139A小鼠脑组织匀浆10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL。
浓度经50μg/mL蛋白酶K（PK）处理前后的检测结果，在长时间曝光的情况下，能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL。
图5
正常的C57小鼠作为底物，将种子稀释为10-2g/10mL至10-9g/10mL浓度进行PMCA实验，连续扩增三轮。
每轮实验结束后，取出反应产物经50μg/mL蛋白酶K消化后进行PrP特异性WesternBlot检测，结果显示，C57-BL/6小鼠脑匀浆未经PK酶消化时，可检测到总PrP蛋白。
经PK酶消化后，正常的PrPC蛋白全部被消化掉，结果显示无特异性条带，随着PMCA扩增次数的增加，PMCA扩增效率逐渐增加。
PMCA第一轮时，能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-5g/10mL，而PMCA第二轮和第三轮时，能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-9g/10mL。
图6
将上述方法中制备的小鼠朊病毒毒株ME7脑组织匀浆作为初始浓度10-1g/10mL。
使用Westernblot分析了ME7小鼠脑匀浆10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL浓度经50μg/mL蛋白酶K（PK）处理前后的检测结果。
在长时间曝光的情况下能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL。
图7
正常的C57小鼠作为底物，将种子稀释为10-2g/10mL至10-9g/10mL浓度进行PMCA实验，连续扩增三轮。
每轮扩增实验结束后，取出反应产物经50μg/mL蛋白酶K消化后进行PrP特异性WesternBlot检测。
结果显示，随着PMCA扩增次数的增加，PMCA扩增效率逐渐增加，PMCA第一轮时，能检测PrPSc条带的最小种子浓度为10-4g/10mL。
PMCA第二轮时，能检测出PrPSc条带的最小种子浓度为10-6g/10mL，PMCA第三轮时，能检测出PrPSc条带的最小种子浓度为10-8g/10mL。
图8
为了观察RT-QuIC方法对小鼠朊病毒毒株ME7的扩增效率，将上述方法中制备的ME7小鼠脑组织匀浆作为种子，rHaPrP90-231作为底物。
用脑匀浆稀释液将种子稀释为10-3g/10mL至10-9g/10mL浓度进行RT-QuIC实验，将C57-BL/6小鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。
结果显示，RT-QuIC方法能检测到ME7小鼠脑组织匀浆的最小浓度为10-7g/10mL。
其中阴性对照和空白对照均为阴性结果，每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值。
图9
将上述方法中制备小鼠朊病毒毒株S15小鼠脑组织匀浆作为初始浓度10-1g/10mL。
使用Westernblot分析了S15小鼠脑匀浆10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL浓度经50μg/mL蛋白酶K处理前后的检测结果。
在长时间曝光的情况下能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL。
图10
为了观察PMCA方法对小鼠朊病毒毒株S15的扩增效率，将上述方法中制备的S15感染小鼠脑组织匀浆作为种子。正常的C57小鼠作为底物。
将种子稀释为10-2g/10mL至10-9g/10mL浓度进行PMCA实验，连续扩增三轮，每轮扩增实验结束后，取出反应产物经50μg/mL蛋白酶K消化后进行PrP特异性Westernblot检测。
结果显示，随着PMCA扩增次数的增加，PMCA扩增效率逐渐增加，PMCA第一轮时，能检测出PrPSc条带的最小浓度为10-5g/10mL。
PMCA第二轮时，能检测出PrPSc条带的最小浓度为10-8g/10mL；PMCA第三轮时，能检测出PrPSc条带的最小浓度为10-9g/10mL。
图11
为了观察RT-QuIC方法对小鼠S15朊病毒毒株的扩增效率，将上述方法中制备的S15小鼠脑组织匀浆作为种子。
rHaPrP90-231作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为10-3g/10mL至10-9g/10mL浓度进行RT-QuIC实验，将C57-BL/6小鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。
结果显示，RT-QuIC方法能检测到S15小鼠脑组织匀浆的最小浓度为10-8g/10mL。
其中阴性对照和空白对照均为阴性结果，每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数。
图12
●—≺对仓鼠朊病毒毒株263K的检测分析≻—●
将上述方法中制备的仓鼠朊病毒毒株263K脑匀浆作为初始浓度10-1g/10mL。
使用Westernblot分析了263K仓鼠脑匀浆10-1g/10mL、10-2g/10mL、10-3g/10mL、10-4g/10mL、10-5g/10mL浓度经50μg/mL蛋白酶K（PK）处理前后的检测结果。
在长时间曝光的情况下能检测到PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL。
图13
为了观察PMCA方法对仓鼠朊病毒毒株263K的扩增效率，将制备的263K感染仓鼠脑组织匀浆作为种子，正常的仓鼠脑匀浆作为底物，将种子稀释为10-2g/10mL至10-9g/10mL浓度进行PMCA实验，连续扩增三轮。
每轮扩增实验结束后，取出反应产物经50μg/mL蛋白酶K消化后进行PrP特异性Westernblot检测。
结果显示，PMCA第一轮时，能检测出PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL，PMCA第二轮和第三轮时，均能检测出PrPSc条带的最小浓度为10-3g/10mL。
尽管朊病毒的扩增效率没有明显的梯度变化，但随着PMCA扩增次数增加，PrPSc条带含量有明显的增加。
图14
为了观察RT-QuIC方法对仓鼠朊病毒毒株263K的扩增效率，将上述方法中制备的263K仓鼠脑组织匀浆作为种子、
rHaPrP90-231作为底物，用脑匀浆稀释液将种子稀释为10-3g/10mL至10-9g/10mL浓度进行RT-QuIC实验，将正常仓鼠脑匀浆和脑匀浆稀释液分别作为阴性对照和空白对照。
结果显示，RT-QuIC方法能检测到263K仓鼠脑组织匀浆的最小浓度为10-9g/10mL。
其中阴性对照和空白对照均为阴性结果，每个点代表四个重复荧光孔荧光强度读数的平均值。
图15
PMCA相比传统方法，提高了检测PrPSc的敏感度，但PMCA也有缺点。
比如无法从脑脊液中检测PrPSc，需要脑匀浆或细胞匀浆来提供反应所需的底物PrPC，检测通量低，一次检测的耗时长，产物具有生物安全危害等。
受到PMCA的启发，日本科学家发明了实时震动诱导蛋白扩增（RT-QuIC）技术，同样利用PrPSc能够诱导PrPC转化这个特性。
但将超声替换为了震荡，并加入能够与淀粉样纤维结合的硫黄素T（ThT），因此机器可以实时监测产生的纤维量。
图 16
RTQuIC技术利用荧光检测的高通量的多孔板的技术，可一次处理大量样品，比多次PMCA和传统的生物测定法效率更高，并且可以实时监测实验的结果，因此更加适合推广至临床标本的检测。
已知朊病毒的感染性是由不同的蛋白酶敏感/抗性亚型组成，RT-QuIC避免了蛋白酶K的使用，从而可以提高对不同蛋白酶敏感亚型的检测。
国际上不同实验室使用的RT-QuIC方法在底物、震荡时间、温度等条件都是不尽相同，且PMCA方法也难以制定标准化程序。
实验室之间即使采用相同的方案，实验结果依旧缺乏一致性。
图 17
在本研究中，我们分别使用来自小鼠的三种朊病毒毒株以及一种来自仓鼠的朊病毒毒株对本室建立的RTQuIC和PMCA方法检测敏感性进行了分析。
我们建立的RT-QuIC和PMCA方法在对不同种属的脑组织朊病毒的检测中，都显示了高于WB的敏感性，
但在本研究中，针对仓鼠朊病毒毒株263K检测时，发现未PMCA扩增的WesternBlot检测PrPSc条带检测到10-3g/10mL稀释度。
图 18
经三轮PMCA扩增后检测PrPSc条带检测到10-3g/10mL稀释度，不同的朊病毒毒株因蛋白空间构象的不同，在进行PMCA扩增的实验时会出现不同的扩增效率。
本研究结果中RT-QuIC和PMCA扩增方法检测PrPSc敏感度与免疫印迹技术技术相比都大大提高了，免疫组化法，蛋白印迹法和生物测定法已被认为是检测PrPSc的金标准。
体外扩增技术的使用有助于我们理解朊病毒的发病机制和传播动力学。
图19
虽然还需要更多的检测，但是有关文献认为RT-QuIC和PMCA可能有助于评估朊病毒的传染性，而不是生物测定。
与以前对仓鼠和一些小鼠朊病毒毒株的观察相比，它们的复制速率主要不是由构象稳定性决定的，而是由控制朊病毒聚集体生长速率的特定结构特征决定的。
根据PMCA和RT-QuIC对不同毒株的扩增效率，这些模型动物中的控制朊病毒聚集体生长速率的特定结构特征可能存在差异。
图20
