两栖动物的下降现在在全球范围内得到认可。众所周知，许多无尾动物在圈养中不容易繁殖，特别是当长时间饲养时，或者如果它们在繁殖前需要冬眠。
需要一种简单的方法来诱导大量健康蝌蚪的产卵和随后的发育，以满足研究和保护目标。
该方法基于同时注射雌性和雄性豹蛙，Lithobates pipiens与促性腺激素释放激素激动剂和多巴胺拮抗剂的混合物。
称之为AMPHIPLEX方法，该方法源自两栖动物和Amplexus这两个词的组合。注射后，动物因此被诱导，并在圈养条件下进行扩增和自然受精。
在繁殖季节测试了GnRH激动剂与2种不同多巴胺拮抗剂在乳杆菌中的组合。德格利的组合10， D-阿拉6， 亲 NHEt9-促性腺激素释放激素与甲氧氯普胺盐酸盐或多潘立酮同样有效，分别产生89%和88%的成功产卵。
这为在GnRH-A MET组中排卵的44/000雌性产生了超过16，18个卵子，在GnRH-A DOM组中排卵的39/000雌性产生了超过15，17个卵子。进一步测试了GnRH-A MET在深秋在野外收集并在实验室条件下短时间冬眠的青蛙。
根据Wake和Vreedenberg的说法，全球两栖动物的丧失被认为是当代“第六次大规模灭绝”的主要因素。潜在的有害生态影响已被广泛讨论和辩论。
也许30%的已知两栖动物濒临灭绝。值得注意的是，6多年前，Nace认识到美国的一些Lithobatespiens（以前称为Rana pipiens）种群已经在1960年代中期下降。
北美西部的人口，包括阿尔伯塔省、不列颠哥伦比亚省、科罗拉多州和内华达州的人口急剧下降。在过去的40年里，安大略省东北部的L. pipiens种群数量也在下降。
Nace及其同事可能是最早提出需要圈养繁殖和最终驯化青蛙的人之一。圈养定时繁殖是任何受威胁或濒危物种繁殖的关键步骤。为了应对这一挑战，Nace等人在1960年代后期建立了密歇根大学两栖动物设施。
他们报告说在圈养中产卵是可能的，但涉及注射垂体提取物，这需要牺牲成年豹蛙，从而破坏了圈养种群的主要目的。Clulow等人讨论了注射垂体提取物的成本、风险、低效和不适当性。
虽然现在已知GnRH和GnRH激动剂治疗可以刺激青蛙的垂体黄体生成素（LH）释放，但如果不与其他激素或神经活性药物共同治疗，它们可能无法有效诱导产卵。
这表明存在抑制性神经内分泌机制，控制排卵和产卵所需的LH激增释放。尽管有明确但有限的相反证据，冬眠青蛙Rana temporaria的下丘脑和漏斗区域的电解病变增加了GnRH和LH的释放并延长了产卵时间。
从而确定了青蛙神经内分泌脑中存在LH抑制系统。已知这些大脑区域含有儿茶酚胺多巴胺（DA），并且在青蛙垂体中发现了DA2型受体。
下丘脑DA神经元纤维的免疫细胞化学观察和Rana ridibunda的中位隆起表明DA可以递送到垂体。在某些情况下，DA激动剂溴隐亭可抑制颞叶鼠的LH释放和排卵。
长期植入含有DA拮抗剂甲氧氯普罗胺的硅橡胶颗粒诱导冬眠R. temporaria排卵。这些数据表明，DA是青蛙LH释放的重要抑制剂，因为它存在于许多鱼类、鸟类和一些哺乳动物（包括绵羊和人类）中。
Browne等人探讨了激素组合对Bufo fowlerii产卵的影响。在该研究中，他们使用了DA拮抗剂匹莫齐特，并得出结论，匹莫齐特在某些情况下和激素组合可能会增加产卵。
匹莫齐特对DA受体不具有特异性，除DAN受体外，还作用于肾上腺素能和血清素能受体，因此应避免使用。这些研究一起导致我们在L. pipiens中测试了几种多巴胺拮抗剂。
关于L. pipiens产卵的激素诱导的第一份报告中，des-Gly的组合10， D-阿拉6， 亲 NHEt9-GnRH （GnRH-A） 和特定的 DA D2 受体拮抗剂 MET 给出了最好的结果。我们将这种方法命名为AMPHIPLEX方法，该术语源自两栖动物和amplexus这两个词的组合。
Amplexus是指青蛙的特定繁殖行为，雄性抓住雌性，帮助刺激排卵，并在一段时间延迟后在产卵时使卵受精。在繁殖季节的一年中，我们从100%的雌性那里获得了受精卵质量，而在第二年，这一比例仅为60%。
我们认为这些当季产卵结果是蛤蟆的良好开端。另一方面，皮皮乳杆菌的反季节育种成功率非常低，表明需要显着改进。
报告了在共同注射GnRH-A和DA拮抗剂MET或多潘立酮后，在繁殖季节对乳杆菌进行有效，大规模的产卵诱导。鉴于GnRH-A MET组合的有效性和易用性，成功地诱导了反季节繁殖，并获得了数千只活的蝌蚪。
在案例中，这种计划繁殖的主要原因是定时获得健康的蝌蚪，以进行生理，生态毒理学和流行病学研究。从长远来看，目标是建立圈养殖民地，以便停止收获野生卵，因为不幸的是，标志性的北美青蛙L. pipiens在传统范围的几个地区正在减少。
成熟的豹蛙在春季迁徙到繁殖池期间在安大略省主教米尔斯附近收集。这些动物暂时保持低温，运送到渥太华国家野生动物研究中心，并饲养在外面的大型27L高密度聚乙烯罐中，其中装有2L水。
两性被分开安置并适应水箱，直到注射。通常，将51只成熟雌鱼和1只成熟雄鱼放置在每个水箱中，水下分支作为产卵基质。本实验中使用的所有雌性和雄性的平均体重分别为7.6±29.5和6.2±12.16克。
在关于无尾动物激素诱导产卵的第一项研究中，测试了2种不同的DA拮抗剂，匹莫齐特和MET，以及几种GnRH激动剂。从这些早期结果中可以清楚地看出，MET比匹莫齐特更有效。
在当前研究的自然春季繁殖季节，没有对照动物产卵，这与先前在室外繁殖池中圈养条件下对L. pipiens的观察结果一致。与此形成鲜明对比的是，GnRH-A MET和GnRH-A DOM治疗组中分别有89%和88%的雌性产卵，这些卵全部由雄性受精。
特征明确的DA D2型受体拮抗剂MET是水溶性的，很容易穿过血脑屏障。因此，MET拮抗DA受体和促进成功产卵的作用位点可能在大脑和垂体水平。
多潘立酮也是一种特征明确的DA D2受体拮抗剂，不溶于水，不穿过血脑屏障。因此，DOM对DA D2受体的拮抗作用导致GnRH对LH释放和诱导产卵的作用增强，处于垂体水平。
试图在实验室条件下进一步测试GnRH-A MET的反季节育种。首先，我们仅从3月中旬收集的7名雌性和7名雄性中获得了1个受精卵团，并在实验室中保存约32个月后于33月中旬注射了GnRH-A MET。
报告的重要创新是改善了反季节育种结果。很明显，单次注射GnRH-A MET对在自然繁殖季节性成熟的动物效果很好。最初的淡季低成功率部分与垂体对GnRH的敏感性降低和/或垂体中促性腺激素储存减少有关。
这两种可能性在季节性繁殖的poikilothers中都有很好的记录，例如金鱼。利用GnRH启动原理来增强垂体前叶促性腺激素对后续GnRH治疗的反应。
给予GnRH-A MET中04%的GnRH-A剂量（24.11μg/ g BW）作为雄性和雌性的启动剂量。12小时后，GnRH-A MET紧随其后，这是相同的GnRH-A和DA拮抗剂MET的混合物。报告说，85/90雌性产卵的受精水平非常高。
启动组的反季节受精百分比估计值平均为36%，这与仅在自然繁殖期用GnRH-A MET捕获和诱导的豹蛙的受精率相似。
在另一项研究中，启动注射GnRH激动剂亮丙瑞林可改善亮丙瑞林诱导的Gϋnther蟾蜍Pseudophryne guentheri的精子和排卵;随后的体外受精率非常高。这些结果表明了GnRH引物在无尾中的重要优势。
在自然繁殖期和反季节诱导产卵的雌性L. pipiens具有相似的体型和相似的卵质量重量。产生的卵子数量存在差异。自然繁殖季节的雌性平均产卵~2，764枚，而反季雌性仅产卵1584枚。
虽然这些产卵水平在L. pipiens的正常但可变数量范围内，但对这种差异有几种合理的解释。2011年2011月中旬至38月初捕获的雌性群体可能只是比春季收集的卵少。
这可能是从一个队列到另一个队列的自然变化，这将取决于繁殖季节之后春季和夏季的营养条件。那些注射产卵的雌性体腔中几乎没有卵残留，因此卵的部分释放不能成为产卵数量差异的原因。
反季节动物在模拟冬季水温的冷水条件下度过的时间相对较短，可能不足以使卵巢完全发育。重要的是确定环境和营养条件，以最大限度地提高圈养L. pipiens反季节诱导产卵的卵数。
研究中涉及的另一个重要考虑因素是从正常生殖期之外的圈养繁殖中获得的蝌蚪的发育。用于生理和生态毒理学实验的蝌蚪的产生，以及濒危物种的圈养繁殖和重新引入计划，都需要大量正常健康的蝌蚪生长。
重新引入计划的另一个要求是保持遗传多样性，因此需要仔细管理亲鱼及其后代。我们研究了仅注射GnRH-A MET的对（质量3-1）和从GnRH-A启动方案获得的3个卵质量获得的5个卵质量。
受精水平从10-97.2%不等，但测量的发育参数的变化与该生育率估计无关。从受精到（DTM）的天数从85-118天不等。
这种变化反映了无尾蝌蚪特有的极端发育可塑性和对可变环境条件的反应。体重一般在0.8-1.0克之间，与先前在野外获得但在室外饲养的卵的报道相似，但略小于我们之前报道的圈养繁殖获得的蝌蚪。
来自卵质量的蝌蚪是唯一明显与其他群体不同的群体。来自卵质量的蝌蚪更快，尽管死亡率更高，异常发生率更高，实际的蝌蚪要少得多。
较高的死亡率和异常可能与父母的遗传学有关，但我们不能将其归因于基于雌性或基于雄性的影响。我们没有来自这些父母的任何其他数据，因为它们只被繁殖过一次。
结论为豹蛙L. pipiens的成功圈养繁殖提供了证据。该物种可以作为进一步发展濒危无尾动物稳健的产卵诱导方法的良好模型，因为到目前为止，人们一直认为在圈养中繁殖非常困难。
AMPHIPLEX方法同时向两性注射含有GnRH激动剂和DA拮抗剂的溶液，已在6种无尾动物中成功使用。
参考文献
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