基因转录是了解铁和血红素调节的重要因素，通过对中耳炎的龙猫进行体内实验，发现它身体内部的铁血红素进行了基因转录，因此研究人员可以将龙猫作为在临床感染期间重要的假设。
一、流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌菌株的微阵列，是可以分析导致铁血红素响应基因核心。
研究人员阐明了流感嗜血杆菌基因的保守核心，其转录因生长环境中铁和血红素的可用性而改变，并进一步评估这些基因在体内的转录。
龙猫体内的细菌病原体，共同进化出多种机制，克服这些防御并利用螯合的微量营养素。流感嗜血杆菌是一种特异性病原体，通常作为鼻咽腔的共生体存在。流感嗜血杆菌可升至咽鼓管，可扩散至COPD合并囊性纤维化患者的肺部疾病，也可引起侵袭性疾病。
流感嗜血杆菌居住的这些多种环境都可能受到铁和血红素（FeHm）的限制，并且可能与定植或入侵细菌可用的铁或血红素来源不同。为了克服这种FeHm限制并利用可能的FeHm来源的多样性，流感嗜血杆菌已经进化出一系列复杂的机制，专门针对含铁或血红素的蛋白质作为这些必需微量营养素的来源。
流感嗜血杆菌对血红素有绝对生长需求，该要求专门针对直接血红素前体原卟啉IX（PPIX），因为大多数菌株具有铁螯合酶。在人类宿主中，基本上没有游离的PPIX，血红素的潜在来源是细胞内，以血红蛋白或含血红素的酶的形式存在，而入侵的微生物无法利用这些酶。
红细胞裂变释放的血红蛋白，与血清蛋白结合珠蛋白密切结合，血红蛋白-结合珠蛋白复合物被肝细胞迅速从循环中清除。游离血红素主要来源于高铁血红蛋白的分解，与血清蛋白血红素或白蛋白结合，并被肝细胞从循环系统中清除。
流感嗜血杆菌利用血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物、血红素-血红素和血红素-白蛋白复合物需要一个功能性tonB基因，表明从这些宿主来源摄取血红素是由TonB依赖性外膜蛋白（TD-OMPs）介导的。
铁的另一个来源是血清铁转铁蛋白，其利用由TD-OMP TbpA介导。既往研究已经表征了铁和血红素的潜在来源，包括转铁蛋白、血红蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白、血红素-血红素和血红素-白蛋白复合物，以及许多介导其利用的OMP。
之前，我们表征了三种不相关的全测序流感嗜血杆菌分离株菌株，R2866从FeHm饥饿环境过渡到充满FeHm的环境时发生的转录变化，这些数据确定Rd KW20有162个基因有反应，而两种临床分离株具有显着更多的此类基因，三种菌株中74个基因的转录均被FeHm水平改变。
此外每个分离株都有几个基因，其调控是该分离株独有的。Rd KW20有15个基因被FeHm限制上调，这些基因存在于其他分离株中，但未被调节。菌株10810有78个，R2866有35个这样的基因。每个分离株还有一个基因子集，这些基因子集对该分离株不同，并且对FeHm水平有反应。
目前的研究有两个具体目标：通过表征另外两种NTHI菌株86-028NP和R2866的体外转录组，进一步评估流感嗜血杆菌的FeHm核心调节因子，它们分别从OM患儿的鼻咽和中耳分离;评估体外FeHm水平对基因转录的调节是否准确反映了急性OM动物模型中相同基因在体内的转录状态。
二、分离物NTHi 86-028NP和R2846的微阵列分析微阵列芯片，其中包含NTHi分离物86-028NP和R2846的所有编码区域。以前的同一芯片已被用于研究Hib菌株10810和NTHi菌株R2866的FeHm模子。
从每个实验样品中纯化约50–60 μg总RNA，并提交给NimbleGen Inc.，在微阵列分析之前对样品进行内部质量控制。在对应于NTHi 1820-86NP基因的阵列上的028个ORF中，64个以统计学显着的方式差异转录。在这64个基因中，39个（61%）在FeHm限制条件下优先转录，25个（39%）在FeHm充满条件下被最大限度地转录。
在对应于NTHi R1664基因的阵列上代表的2846个ORFS中，有94个（5.6%）被显着差异转录。在这94个基因中，70个（74%）在FeHm限制条件下最大转录，24个（26%）在FeHm充满条件下转录。在两组微阵列数据中，已知的FeHm可抑制基因tbp1，hitA和hxuC的转录本在FeHm限制下升高，而组成基因ompP2的转录本显示两种分离株均未发生显着变化。
这些发现与初步的定量PCR（Q-PCR）实验一致。与之前的微阵列研究相比，86-028NP和R2846中对FeHm状态改变的反应基因数量低于先前报告的分离株。这种差异可能反映了这些分离株的接种物培养物初始生长中所需的额外血红素的结果。
三、微阵列芯片数据的验证选择几个基因通过Q-PCR进行分析，以验证微阵列数据。对每种分离物进行单独的实验，以使用与微阵列分析描述的相同条件从FeHm耗竭和富足细胞中纯化RNA。分析每种分离株的基因包括十个在FeHm限制或补充下优先表达的基因示例。我们观察到Q-PCR和微阵列转录数据之间的一致性为100%。
感嗜血杆菌分离株86-028NP、R2846、R2866、Rd KW20和10810微阵列数据比较。在对流感嗜血杆菌FeHm响应基因的初步分析中，表征良好的实验室菌株Rd KW20具有80个FeHm-ve基因和82个FeHm ve基因。添加来自Hib分离株10810和NTHi分离株R2866的数据，随后建立了37个FeHm-ve和37个FeHm ve基因的共同核心，这些基因响应这3种菌株中的FeHm可用性。
将这些数据与从R2846和86-028NP新获得的数据相结合，现在可以进一步完善流感嗜血杆菌核心FeHm模子的定义。我们现在将一个基因定义为该模子的成员，如果它在评估的4个分离株中的至少5个中得到显着调节。在少数操纵子中，启动子远端的一个或两个基因可能已降至1.5倍包涵限制以下，但如果它们在至少3个分离株中受到调节，则作为核心的一部分包括在内。
四、临床NTHi分离株HI1722中FeHm核心模块的体外检查我们无法利用菌株R2846进行体内研究，因为在龙猫感染动物的初步实验中，内耳感染的症状迅速出现，这代表了终止协议的标准。因此，选择另一种菌株进行体内转录测定。这些研究选择NTHi分离株HI1722，因为它是从OM患者中分离出来的，并且之前已在OM的龙猫模型中使用。
为了便于体内检查，对该分离株进行了部分基因组测序，以确定是否存在核心FeHm响应基因和单个基因的序列，以确保Q-PCR引物的同源性。与NTHi菌株86-028NP和R2846类似，菌株HI1722需要用2μg/ ml血红素预孵育以防止在调节研究的时间过程中死亡。最初检查基因tbp1，hxuC和ompP2的转录反应。观察到每个基因的表达动力学与先前研究的其他五种分离株相似的表达动力学。
五、86-028-NP和HI1722核心模子在龙猫实验OM中的转录状态这项研究的一个主要目标是确定龙猫中耳中核心FeHm-modulon基因的体内转录状态，这是一种临床相关的疾病动物模型。为了能够直接比较体内和体外衍生样品之间的转录水平，将每种样品标准化为补充各自分离株的体外培养物的零FeHm时间。
通过这种方式，耳样本的Q-PCR测定的表达水平可以与体外FeHm去除补充值进行比较，因为它们都归一化为相同的内部“管家”基因gyrA。从本质上讲，体外数据提供了两个转录状态指标，一个对应于上调的较高水平，另一个对应于完全FeHm抑制的基础转录的较低水平。对于FeHm核心中的每个基因，已经确定了响应体外FeHm添加的转录物的倍数变化。
由于完全抑制的样品用作归一化器，因此所有其他值都是“相对于完全抑制的倍数变化”，因此高于 1.5 的正数表示转录增加， /- 1.5 之间的值不被视为表示变化，低于 -1.5 的值进一步抑制。为了验证FeHm核心中的基因在体内转录的假设，感染了龙猫队列，并在不同时间收集了耳积液样本，以确定FeHm核心模组中基因的转录状态。
在每个样品中每个感兴趣的基因进行Q-PCR之后，确定每个基因的一组转录图谱，并与体外数据进行比较。每个分离株中每个基因的Q-PCR结果以及体外生长样品的数据。
个体体外FeHm模子表明，86-028NP和R2846彼此之间比我们先前研究中表征的三种分离株中的任何一种更相似。 这可能仅仅是由于当前研究中需要额外的血红素。在新描述的模子中，调控基因较少。这在FeHm充满条件下优先表达的基因亚群中最为明显。
此外，目前的研究测试了在FeHm饥饿条件下优先表达的基因在实验性感染期间在中耳中同样上调的假设。这些研究选择了以前在龙猫模型中使用的两种分离株。在NTHi菌株HI1722中，在体外FeHm耗竭条件下上调的每个核心基因在实验性中耳炎培养基期间也明显上调。
结合86-028NP中几乎所有FeHm-ve基因在体内高度转录的观察结果，这些发现验证了在FeHm限制生长下优先转录的流感嗜血杆菌基因在OM期间也在中耳转录的假设。
六、基因调控分离龙猫耳中基因调控的靶向检查，并未解决所有可能导致该环境中任何特定分离株毒力的FeHm调控基因。相反，该研究的重点是核心FeHm响应基因;微阵列研究清楚地表明，每个分离株都含有额外的基因，这些基因在体外对FeHm应激有反应，这些基因不符合作为核心模子成员的标准。
这种非核心FeHm响应基因很可能在体内也会上调，而且龙猫耳朵存活所需的可能不仅仅是核心基因。核心FeHm模块包含35个在FeHm耗尽条件下优先转录的基因和20个在FeHm充满条件下优先转录的基因。然而，在所有5个研究分离株中，FeHm调节基因的总数约为250。非核心基因库很可能允许适应宿主内不断变化的宿主和环境生态位。
众所周知，流感嗜血杆菌是天然可转化的，并且是分离株之间共享基因。这是分布式基因组假说的基本原理，可以部分解释体外分离株之间，存在调节异质性的原因，以及在单个分离株中调节的各种基因的基因组存在差异。
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