抽象
猫冠状病毒（FCoV）是家猫和野猫中严重系统性疾病（猫传染性腹膜炎：FIP）的病原体。FCoV已被分为血清型I和II。I型FCoV是全球主要的血清型（约70–90％）。因此，有必要提供用于I型FCoV感染的抗病******。在这项研究中，我们证明了伊曲康唑（ICZ）实际上用于猫的真菌感染，可抑制I型FCoV感染。病毒感染后，ICZ在细胞中也表现出抗病毒作用，这表明ICZ可能被用作治疗剂。
引言，方法和结果猫冠状病毒（FCOV;家庭冠状，属Alphacoronavirus）是一种有包膜的，单链的，正链RNA病毒。FCoV以两种不同的生物类型存在：猫肠道冠状病毒（FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）[ 1 ]。前者引起轻度肠炎（通常是亚临床感染），而后者则引起高度致命的全身性疾病FIP。尽管已经研究了针对FIP的抗病******物和疫苗，但尚未建立可实际使用的方法[ 2 ]。此外，FCoV还以两种血清型存在：I型FCoV（I型FECV和I型FIPV）和II型FCoV（II型FECV和II型FIPV）[ 3]。血清学和基因的调查表明，I型FCOV是显性的全球[ 4，5，6 ]。
我们先前曾报道，在整个病毒生命周期中，I型FCoV与胆固醇密切相关[ 7 ]。我们还证明了胆固醇转运抑制剂U18666A可以强烈抑制I型FCoV感染[ 8 ]。基于这些发现，U18666A可用作FIP的治疗药物。但是，据我们所知，U18666A未被批准用于兽医实际用途。要使用U18666A来治疗FIP，必须对猫进行药代动力学，药效学和安全性研究。与U18666A，几个候选抗病******物靶向I型FCOV已经确定[ 9，10]。但是，实际上没有科学证明对FIP表现出治疗作用的药物。为了解决这些问题，期望在通常用于猫的药物中鉴定用于FCoV感染的有效抗病毒剂。
伊曲康唑（ICZ）被归类为唑类抗真菌药[ 11 ]。它毒性低，可用于治疗免疫功能低下患者的真菌感染[ 12 ]。兽医通常将其用于治疗狗和猫的真菌感染。最近，ICZ被认为对肠道病毒感染（脊髓灰质炎病毒，鼻病毒和柯萨奇病毒）有效[ 13 ]。我们之前研究了包括U18666A在内的胆固醇转运抑制剂的抗病毒作用，并确认ICZ抑制了I型FCoV感染[ 8 ]。但是，尚未详细研究ICZ对FCoV感染的影响。在这项研究中，我们检查了ICZ对FCoV的抗病毒作用。
使用对I型FIPV，II型FIPV和II型FECV敏感的猫全胎（fcwf）-4细胞。ICZ（ITORIZOLE ®）是由西安杨森制药株式会社（日本东京）购买。对于ICZ的溶剂，使用包含2.5％（v / v）的丙二醇和0.376％（v / v）的盐酸的40％（w / v）的羟丙基-β-环糊精（日本FUJIFILM Wako Pure Chemical）。用溶剂将ICZ调节至10 mM，等分，并保存在-30°C下直至使用。使用维护培养基（MEM）稀释ICZ。为了评估ICZ和溶剂在fcwf-4细胞中的细胞毒性作用，如前所述通过WST-8测定细胞活力[ 7]。使用以下公式计算细胞毒性百分比：细胞毒性（％）= 100-[（ICZ（或溶剂）处理过的细胞的OD / ICZ（或溶剂）未经处理的细胞的OD）]×100。 ICZ和溶剂的稀释剂为7.5–7.6。ICZ的50％细胞毒性浓度（CC 50）和10％细胞毒性浓度（CC 10）值分别为208.0±22.9（均值±SE）μM和1.1±0.4（均值±SE）μM（图 1）。
图1
ICZ对fcwf-4细胞的细胞毒性作用。如前所述[ 7 ]，通过WST-8测定法测量了fcwf-4细胞的活力。黑色圆圈表示使用ICZ的处理，白色圆圈表示使用溶剂的处理（溶剂对照）。每次连续稀释时，溶剂浓度与ICZ溶液中的浓度相同。数据代表三个独立的实验。
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ICZ对fcwf-4细胞中3株I FCoV株（FIPV-1 KU2，FIPV-1 UCD1和FIPV-1 UCD4），1株II FCoV（FIPV-II WSU79-1146）感染的影响被调查了。将融合的fcwf-4细胞单层细胞在含有ICZ的指示浓度的37℃24孔多孔板中的培养基中培养24小时。洗涤细胞，并将病毒（MOI 0.01）在37℃下吸附到细胞上1小时。洗涤后，将细胞培养在羧******纤维素（CMC）-MEM或无CMC的MEM中。要使用24孔塑料板进行噬菌斑抑制测定，必须在小面积的单层细胞中清楚地制备噬菌斑，对于CMC-MEM比琼脂-MEM更适合覆盖培养基。对于噬菌斑抑制测定，将在CMC-MEM中培养的细胞在37°C下孵育48小时，固定并用含有10％福尔马林缓冲液的1％结晶紫溶液染色，然后对所得噬菌斑计数。使用以下公式计算噬菌斑抑制百分比：噬菌斑抑制百分比（％）= 100-[（经化合物处理的细胞的菌斑数）/（未经化合物处理的细胞的菌斑数）]×100。 MEM，在感染后48小时收集培养上清液，并通过滴定测定法测定病毒滴度。用ICZ预处理以剂量依赖的方式减少了I型FCoV的斑块形成（图 噬菌斑抑制百分比（％）= 100-[（经化合物处理的细胞的噬菌斑数）/（未经化合物处理的细胞的噬菌斑数）]×100。对于在MEM中培养的细胞，在上清后48 h收集培养上清液感染，并且通过滴定测定法测定病毒滴度。用ICZ预处理以剂量依赖的方式减少了I型FCoV的斑块形成（图 噬菌斑抑制百分比（％）= 100-[（经化合物处理的细胞的噬菌斑数）/（未经化合物处理的细胞的噬菌斑数）]×100。对于在MEM中培养的细胞，在上清后48 h收集培养上清液感染，并且通过滴定测定法测定病毒滴度。用ICZ预处理以剂量依赖的方式减少了I型FCoV的斑块形成（图 2 A）。I型FCoV形成的斑块被0.03–20μMICZ抑制。相反，用ICZ预处理对II型FCoV的噬菌斑抑制百分比略有影响。表1示出了基于噬菌斑抑制试验和细胞毒性试验的结果，每种病毒的ICZ的IC50和SI（CC50 / IC50） 。根据滴定分析，ICZ剂量依赖性地降低了I型FCoV的产生（图 2）。B）。仅当添加20μMICZ时，II型FCoV的产量才略有下降。接下来，我们调查了病毒蛋白的表达，以进一步评估ICZ对FCoV感染的影响。Fcwf-4细胞在8孔Lab-Tek Chamber Slide（Thermo Fisher Scientific，USA）上生长。将融合的fcwf-4细胞单层细胞在37°C的含20μMICZ的培养基中培养24小时。洗涤细胞，并将病毒（MOI 0.01）在37℃下吸附到细胞中1小时。洗涤后，将细胞在MEM中培养。将细胞单层在37°C下孵育。72小时后，如先前所述[ 14 ] ，通过免疫荧光测定（IFA）确定了核衣壳蛋白水平。为了识别FIPV N蛋白，使用了我们实验室制备的mAb YN-2（小鼠IgG2b）[ 15]。细胞核用4'，6-二mid基-2-******吲哚（DAPI； Dojindo实验室，日本）染色。在用ICZ预处理的fcwf-4细胞中，FIPV-1 KU2的N蛋白水平特别降低。与FIPV-I KU2相比，用ICZ进行的预处理不会影响fcwf-4细胞中FIPV-II 79-1146的N蛋白水平（图 2 C）。
图2
ICZ对I型FIPV和II型FIPV的抗病毒作用。 阿与ICZ处理FCWF-4细胞FCOV的斑块抑制测定。黑条表示用ICZ处理，白条表示用溶剂处理（溶剂对照）。结果显示为平均值±SE。数据代表四个独立的实验。* p <0.05，相对于溶剂对照。B ICZ在fcwf-4细胞中抑制FCoV感染。黑条表示用ICZ处理，白条表示用溶剂处理（溶剂对照）。结果显示为平均值±SE。数据代表四个独立的实验。* p <0.05，相对于溶剂对照。a：相 对于溶剂对照，p＝ 0.054。B：p 相对于溶剂对照＝ 0.082。c：相 对于溶剂对照，p＝ 0.052。C ICZ对FCoV核衣壳（N）表达的影响。通过IFA评估FCoV N蛋白。数据代表三个独立的实验。D后处理对ICZ抗病毒活性的影响。KU2：FIPV-1 KU2菌株，UCD1：FIPV-1 UCD1菌株，UCD4：FIPV-1 UCD4菌株，1146：FIPV-II WSU 79-1146菌株，ICZ：伊曲康唑。
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表1 伊曲康唑的CC50，IC50和SI
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此外，我们检查了用FIPV-1 KU2感染fcwf-4细胞后ICZ对斑块形成的影响。将MOI为0.01的病毒添加到培养物中，并在37°C下被fcwf-4细胞吸附1 h。洗涤后，将细胞在MEM中于37°C下培养1或3 h。将MEM换为含ICZ的CMC-MEM后，将细胞在37°C下培养48小时。如上所述测量噬斑抑制的百分比。用ICZ后处理可抑制FIPV-1 KU2斑块形成，其程度可与前处理相比（图 2 D）。相反，用FIZ-II 79-1146抑制斑块的百分比受ICZ后处理的影响很小。
胆固醇转运抑制剂U18666A强烈抑制I型FCoVs感染[ 8 ]。据报道，ICZ抑制细胞内胆固醇的转运，与U18666A相似[ 16]。因此，我们评估了ICZ是否抑制猫细胞中细胞内胆固醇的运输。根据制造商的说明，使用基于胆固醇细胞的检测分析试剂盒（美国开曼化学）评估fcwf-4细胞中的细胞胆固醇含量。简而言之，fcwf-4细胞在8孔Lab-Tek Chamber Slide（Thermo Fisher Scientific，USA）上生长。将半融合的fcwf-4细胞单层细胞在含有20μMICZ或2μMU18666A（FUJIFILM Wako Pure Chemical，Japan）的培养基中于37°C培养24小时。固定和染色后，使用Leica DM4B显微镜和LAS X集成成像系统（Leica Microsystems，德国）分析被Flipin III染色的细胞。ICZ诱导的细胞胆固醇蓄积，与U18666A相似（图 3一种）。为了确定ICZ是否影响细胞胆固醇含量，测量了fcwf-4细胞中的胆固醇水平。按照制造商的说明，使用Amplex Red胆固醇测定试剂盒（Molecular Probes，美国）测定细胞内胆固醇的量。2.5μM和20μMICZ都不能像2.0μMU18666A一样降低细胞胆固醇水平（图 3 B）。
图3
ICZ对fcwf-4细胞中胆固醇积累和细胞胆固醇水平的影响。 一个ICZ诱导细胞内胆固醇的积累。细胞中的胆固醇含量通过磷脂-胆固醇染色评估。白色方块内的区域在白色箭头指示的单元格中被放大。B fcwf-4细胞中细胞胆固醇的定量。数据代表三个独立的实验。
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讨论区在2种血清型中，ICZ抑制了I型FCoV感染。与FIP猫的大约70-90％被感染的I型FCOV [ 4，5，6 ]，这将是合理的测试使用ICZ作为抗FIPV剂。另一方面，ICZ不会影响II型FCoV，这提示ICZ的抗病毒作用取决于FCoV的血清型。II型FIPV诱导FIP在日本和台湾地区的发病率比欧洲[高6，17，18 ]，和ICZ与其他药物结合是必要的，这些国家。
在用2.5μMICZ处理的病毒感染的细胞中，噬菌斑抑制和病毒滴定分析的结果之间存在差异：在前者中观察到对I型FIPV感染的显着抑制作用，但在后者中未发现显着的抑制作用。由于噬菌斑抑制法测定的是亲代病毒的感染力效价，而病毒滴定法测定的是后代病毒的效价，这些发现表明2.5μMICZ强烈抑制了亲代病毒的感染，但浓度不足以抑制后代病毒的产生。但是，产生的子代病毒的滴度和噬菌斑抑制分析结果强烈表明，在用2.5μMICZ处理的细胞中，子代病毒感染受到抑制。
布特等。[ 19 ]先前报道了ICZ在猫中的药代动力学变量。根据他们的报告，口服ICZ一次10 mg / kg的猫的峰值血药浓度（Cmax）为1.1±3.6μg/ mL（1.6±5.1μM），达到3.4±1.3μg/ mL（4.8±在12小时间隔内，口服ICZ两次治疗的猫的实验结果为1.8μM）。在本研究中，在用2.5μMICZ处理的fcwf-4细胞中，噬菌斑形成和病毒抗原表达受到抑制，并且在用FIPV-1 KU2感染后用ICZ处理的细胞中观察到了类似的作用，这表明以10 mg的剂量施用ICZ每天两次，每公斤被诊断患有FIP的猫可能会降低病毒载量。为了治疗猫的真菌感染，在早期阶段以高剂量（最高26.7 mg / kg）施用ICZ [ 20]。在早期以高剂量给予ICZ可能还会对FIP产生抗病毒作用。持续高剂量ICZ时，血液丙氨酸氨基转移酶据报道会增加，但在停药后这种症状有所改善[ 20 ]。我们建议兽医按照猫的真菌感染治疗方案，将ICZ用于FIP的治疗。
我们以前曾报道过，U18666A通过作用于胆固醇转运蛋白Niemann-Pick C1蛋白（NPC1）来抑制胆固醇转运和I型FIPV感染[ 8 ]。在这项研究中，证实了ICZ对细胞内胆固醇转运的抑制作用。由ICZ引起的细胞质中胆固醇的积累已经报道了一些研究[ 14，21除了本研究以外，但其机制尚未阐明。最近有报道说，ICZ通过作用于NPC1诱导溶酶体中的胆固醇蓄积。根据此报告，ICZ可能通过与U18666A相同的机制抑制I型FCoV复制。此外，在I型FCoV以外的病毒中，ICZ通过作用于NPC1以外的蛋白质来抑制感染。例如，据报道ICZ作用于氧固醇结合蛋白（OSBP）并抑制肠病毒中病毒复制细胞器的形成[ 14 ]。假定冠状病毒的复制位点与内质网（ER）衍生的结构相关，通常称为双膜囊泡（DMV）[ 22]，但是尚不清楚OSBP是否参与冠状病毒中病毒复制细胞器的形成。I型FIPV感染与OSBP之间的关系需要研究。
在这项研究中，我们证实了ICZ可以抑制I型FIPV（该领域的优势菌株）的感染，这表明ICZ可以用作FIP的治疗药物。FIP是一种“多因疾病”，涉及多种风险因素（FCoV的毒力，宿主的免疫状况以及病毒感染的途径等）。考虑到这一事实，我们计划使用诊断为FIP的猫进行ICZ的临床试验，并同时研究与其他治疗性药物的FIP组合。
