文：远笙纪
编辑：远笙纪
自1985年起，中国福建省的仙游、安溪、福州、福清等地相继爆发了一种雏番鸭疫病，其主要症状为腹泻、呼吸困难和软脚。
随后，广东、广西、湖南等省份以及法国、匈牙利、日本等地也相继报告了该病的发生。
这种疫病主要侵害大约3周龄左右的雏番鸭，其发病率为27%～62%，病死率为22%～43%。
病愈的鸭子大多成为僵鸭，失去了经济价值，对养鸭业造成了巨大的危害。因此，这种病已引起各国学者的高度重视，并相继进行了有关病原学的研究工作。
程由铨等学者从患有腹泻和呼吸困难主要症状的雏番鸭肝脾中分离出了两株病毒，将其命名为雏番鸭细小病毒（MDPV）MDPV-P和MDPV-F。
1991年，在布列塔尼和卢瓦尔河地区爆发了番鸭细小病毒病，相关研究人员分离出了两个毒株NX2和GM。
研究表明，MDPV单抗只对MDPV发生特异反应，而不对鹅细小病毒（GPV）发生交叉反应，从而确定MDPV属于细小病毒属的新成员。
由于这种疫病主要危害3周龄左右的雏番鸭，又被称为“三周病”，也因其临床症状主要表现为喘和泻，也被称为传染性喘泻病。
我们发现，在电镜下观察MDPV病毒呈现晶格排列，具有球形或六角形形态，没有囊膜，呈正二十面体对称，直径约为20到24纳米，其核酸为单链DNA，分子量约为5.1千碱基。
此外，病毒粒子编码有四种结构蛋白：VP1（分子量85kD）、VP2（分子量70kD）、VP3（分子量56kD）和VP4（分子量39kD），以及非结构蛋白Rep。
本研究对一些发生喘气、腹泻、脚软、消瘦等症状的雏番鸭肝脾中分离出了一株病毒，并通过乳胶凝集试验及特异性PCR扩增确定为雏番鸭细小病毒。
番鸭胚原代细胞制备及病毒接种所用材料有：疑似细小病毒感染的14天龄非免疫健康番鸭胚，DMEM干粉培养基，牛胰蛋白酶。
10%聚苯乙烯乳胶，聚乙二醇20000（PEG20000）， PCR引物根据GENEBANK发表的MDPV序列，自行设计了一对位于Rep蛋白编码区内的引物。
病料采集：无菌条件下，采取疑似细小病毒的雏番鸭肝、脾，将其冻存于-70°C。用时取出，无菌条件下研磨成肉浆。
将肉浆与生理盐水按5∶1的比例混合，通过6层灭菌纱布过滤，收集滤液，经4000r/min离心10分钟后，取上清，并按常规加入抗生素，作为病毒分离材料。
番鸭胚原代细胞制备及病毒接种：按常规方法制备番鸭胚成纤维单层细胞(MDEF)。将每个25mm培养瓶的细胞浓度设为5mL × 10^6，然后在37°C的温箱中培养24小时。
次日，取80%覆盖的细胞接种病料，同时利用低熔点琼脂糖进行蚀斑克隆：即在接种病毒后，每瓶加入4mL 1∶1体积的琼脂糖（2%）与2×完全DMEM混合培养液，待凝固后，倒置培养于37°C，2-3天即可收集病毒。
使用40枚14天龄非免疫健康番鸭胚，每个胚尿囊腔接种0.1～0.2mL病毒液。24小时内死亡的鸭胚被弃掉，以后每天照蛋两次，死亡胚胎被取出并放置在4°C的冰箱保存。
细胞毒的收获：培养3小时后，取出接种细胞，反复冻融3次，将细胞吹打下来，冷冻保存在冰箱中备用。对于克隆培养的细胞，在出现明显蚀斑时，无菌挑取蚀斑，作为克隆原代毒。
番鸭胚尿囊液毒的收获：7天后将未死的胚胎全部取出，置于4°C冰箱沉淀2小时。收集尿囊液，进行差速离心，吸取上清装入透析袋，在PEG20000中浓缩2小时，使病毒液体积减少为原来的1/10，然后进行回收。
乳胶吸附抗原的制备：取细胞毒和尿囊液毒各1mL，分别加入1%聚苯乙烯乳胶悬液3mL，置于4°C冰箱冷浸吸附3天。
取出后加入结晶牛胰蛋白酶3mg和1%的柳硫汞0.1mL，进行50°C水浴致敏处理24小时。然后进行低速离心5分钟，取上清以4000r/min离心1小时，将沉淀用0.1mol/L甘氨酸缓冲液稀释至原体积（切忌激烈震动及用玻棒直接触动乳胶颗粒），加入0.01%的柳硫汞，即得到乳胶吸附抗原，保存在4°C备用。
阳性血清检测乳胶吸附抗原：使用96孔凝集板进行检测，按照倍倍稀释方法进行，第11孔为阴性对照。
加样完毕后，在震荡器上震荡3～5分钟，置于37°C温箱中作用0.5小时，然后取出观察结果。
细胞毒的核酸提取：接种病毒的MDEF细胞培养大约3天，当细胞出现70%～80%的病变时，弃掉培养液，加入1～2mL裂解液（Tris-HCl: 10mmol/L，NaCl: 10mmol/L，EDTA: 10mmol/L，pH 7.4，蛋白酶K 100μg/mL），放置在37°C温箱中过夜。
第二天吹打细胞并将液体转移到离心管中，加入SDS至终浓度为2%。在37°C作用30分钟后，用苯酚抽提，乙醇沉淀2小时。最后用30μL灭菌水重悬备用。
尿囊液毒的核酸提取：取10mL尿囊液和1g PEG6000，使之充分混合至溶解，然后在4°C冰箱沉淀2小时，取出后进行低速离心，上清进行高速离心以20000r/min离心1小时。
然后将沉淀中加入400μL裂解液，进行50°C水浴处理30分钟。之后再用苯酚、氯仿进行抽提，最后用无水乙醇沉淀后，用30μL灭菌水重悬。
按照表1中的标准进行加样，反应体积为25μL。
表1
经过低熔点琼脂糖回收的PCR产物，克隆至T载体，并选择Pst1、HindIII进行酶切鉴定。其中，Pst1为载体两端各有一个酶切位点，HindIII为载体一端及DNA片段450处各有一位点。
结果在制备MDEF24h后的镜检中，细胞生长状况良好，呈梭形并且大小均匀。随着病毒接种后36小时的推移，细胞逐渐圆缩。
到了大约72小时时，细胞与细胞之间仅由纤细的细胞间桥连接，呈现出网状结构，到了80小时后约60%的细胞自行脱落。在进行蚀斑克隆培养时，可以观察到细胞形成小的红色蚀斑(见图1)。
图1
在接种病毒后的24小时至第9天期间，共有32只番鸭胚中有80%的死亡率。取其中2只死亡的胚胎进行观察，发现绒毛尿囊膜增厚，胚胎充血，胸部、背部和头部出现充血和出血点。
胚胎的死亡时间集中在接种后的3-7天之间，传至第二代时，80%的番鸭胚胎死亡时间稳定在4-7天。
进行聚苯乙烯乳胶凝集试验时，尿囊液毒和细胞毒乳胶吸附抗原与MDPV阳性血清呈现阳性反应，抗原稀释度为1.25 × 10^-3。而MDEF细胞致敏乳胶与MDPV阳性血清呈现阴性反应(详见表2)。
表2
多聚酶链式反应(PCR)结果如图2所示，细胞毒及尿囊液毒在约600bp处均有一扩增条带，与设计片段大小相符，而对照细胞则没有相应条带。
图2
经过酶切反应后的结果如图3和图4所示。载体Pst1的两端各有一酶切位点，而MDPV获得的DNA片段上没有这些位点。HindIII在DNA片段约450bp处有一酶切位点，在载体正向端也有一个位点。
图3
在图3中可见Pst1酶切形成约600bp的条带及2.7kb的质粒带，图4中经HindIII酶切后形成2.8kb及500bp的DNA条带。
图4
这些酶切结果表明所获得的质粒为正向插入，与由序列推断的酶切图谱相一致，进一步证明了克隆到的片段为MDPV Rep蛋白基因片段。
整个实验中，我们详细描述了细胞培养、病毒接种及其对细胞和番鸭胚的影响，以及进行的聚苯乙烯乳胶凝集试验和多聚酶链式反应，最终通过酶切反应确定了所克隆的片段为MDPV Rep蛋白基因片段。
分离雏番鸭细小病毒（MDPV）目前的分离方法主要采用番鸭成纤维细胞和番鸭胚尿囊腔接种法。本研究采用这两种方法进行接种实验，并观察到了较明显的细胞病变以及胚体充血或出血的现象。使用低熔点琼脂糖进行克隆，发现该病毒在细胞上形成小红色蚀斑。
病毒对番鸭胚的致死率约为80%，略低于83%～93%。鉴定该病毒目前多采用常规方法，例如聚苯乙烯凝集试验和ELISA检测等，但这些方法存在灵敏度较低的缺点。
相比之下，利用核酸诊断技术具有灵敏、特异的优点，因此本研究选取MDPV一段较保守的序列进行PCR鉴定，并成功确定本研究分离到的病毒为雏番鸭细小病毒。
PCR方法诊断番鸭细小病毒病根据已有序列，我们设计了一对特异引物，用于扩增MDPV非结构蛋白Rep基因片段。以尿囊液和细胞为模板，进行PCR扩增后成功得到了与设计片段大小相符的600bp DNA条带。
通过对该基因片段进行PstI和HindIII酶切鉴定，证明本研究克隆到的基因片段为Rep蛋白基因片段。从分子水平上证明了分离到的病原为MDPV。我们成功建立了MDPV PCR诊断方法，为临床快速诊断该病提供了新的手段。
我们通过两种接种方法成功分离到了雏番鸭细小病毒，并且通过PCR技术进行了快速准确的诊断。
