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文/内敛且担当
编辑/内敛且担当
引言代谢组学通过测量代谢过程中的中间产物和终产物分子提供了个体当前代谢状态的全面快照，代谢组受多种内部因素的影响，包括基因和蛋白活性，以及饮食和环境等外部因素，以及它们与宿主-微生物相互作用的影响。
这使得代谢组学在理解多因素疾病和生理因素如何影响健康方面具有重要地位，重要的是要区分由生理变异引起的代谢变化与病理性疾病相关的代谢改变。
目前缺乏大规模的代谢组学研究，研究生理因素对犬代谢的整体影响，由于人工选择，有400多个遗传、形态学、生理学和行为学上不同的狗品种，代表了遗传封闭群体，具有高内种群同质性和高品种间异质性，这表明品种在代谢方面也可能存在差异。
样本来自芬兰采集的4816只客户拥有的犬类的血液样本，血样通过头部静脉采血，凝结至少30分钟后，以3000g的速度离心10分钟，分离血清。
血清样本立即冷藏并保存在−80°C，等待核磁共振分析，犬主人填写了关于狗狗目前健康、饮食、运动、压力和生殖状态的问卷。
核磁共振代谢组学分析采用经验证和完全自动化的特异于犬类的核磁共振代谢组学技术，从血清样本中量化了123个测定值，核磁共振方法的细节已在其它地方提供。
数据预处理在Microsoft Excel中进行，后续的统计分析使用R v. 4.0.2 进行，为确保一个均衡和高质量的研究人群，在研究中仅使用了一部分子集。
只包括在采样后45分钟内离心分离的血清样本，以避免红细胞长时间接触的影响，包括根据狗主人的说法健康的狗：在血液采样期间报告患有任何系统性疾病或正在接受治疗的狗被排除在外。
并未只根据关节和背部的常规X光结果来排除狗，而是在狗被报告出现症状或接受治疗时排除，这一方法之所以被选择，是因为疾病的定义总是需要有症状存在，未接受治疗的诊断为轻微眼部疾病的狗未被排除，因为其全身代谢效应被认为是可以忽略的。
在采样期间，我们只包括不处于以下任何激素活跃状态的狗：发情前期和发情期、假孕、怀孕或哺乳期。有四只狗在大多数测定值中缺少数据，因此被排除在外。这导致样本大小为3325只狗。
为了保证统计分析的最佳研究群体，排除了在年龄、性别、绝育状态、品种、体型、饮食和禁食时间方面缺少信息的狗，饮食变量的某些类别样本数量非常低，因此这些饮食的狗被排除在外，饮食变量包含四个类别：生食、干狗粮、生食 干狗粮和多种食品类型，分析样本大小为3030只狗。
为了确保足够的品种特异性样本量，因此仅包括超过35只个体的品种，这导致在22个品种的2069只狗中进行了分析。
缺失值插补许多测定值有多个缺失值，测定值中缺失值超过50%的代谢物被排除在进一步的分析之外，对于缺失值低于50%的代谢物，采用随机森林插补法进行插补，使用‘missForest’包进行插补，其中默认值的missForest函数，经过迭代的标准化均方根误差值为0.00061，表明RF插补在数据上表现良好。
统计分析连续变量的分布通过直方图进行评估，由于分布呈偏态，我们使用广义线性模型，对于每个模型，通过使用‘boot’包和‘rcompanion’包的残差图确定分布和链接函数。
对于大多数测定值，使用了伽马分布和对数链接函数，由于我们无法找到适合数据的分布和链接函数，VLDL三酸甘油酯在GLM分析中被排除在外，最终研究的测定值数量为119个。
我们为每个测定值单独构建模型，以测定值水平作为连续的因变量，年龄、性别、品种、绝育、体型、饮食和空腹时间被选择为可能的解释变量用于模型，我们使用前向逐步Akaike信息准则模型选择方法，逐一添加变量以获得最佳拟合的最终模型，从包含年龄和性别作为解释变量的基本模型开始。
由于体型变量与品种存在高度的多重共线性，因此将其排除在分析之外，我们使用递归的方法进行模型选择，编写了一个用于R的模型选择循环，每个代谢物测定值的最终模型和AIC选择过程。
为了测试连续解释变量的线性假设，我们在模型选择之后使用‘gam’包拟合广义加性模型，如果假设未满足，我们在最终模型中添加了二次年龄。
为了检查模型中可能存在的异常值和有影响力的数据点，使用了‘broom’、‘dplyr’、‘ggplot2’、‘car’、‘gplots’、‘boot’和‘rcompanion’包绘制了标准化残差图，由于某只狗在几个测定值中具有异常值，该狗被排除在所有模型之外。
GLM模型中的最终样本量为2069只狗，来自22个品种，最后使用‘car’和‘lmtest’包分别测试了变量的多重共线性和残差的自相关性，在拟合模型之后，通过‘emmeans’包，计算了分类解释变量的估计边际均值，通过‘effects’包获得了连续解释变量的效应，由于比较的数量较多，所有p值均经过Benjamini-Hochberg假发现率校正，显著性水平设为p值小于0.05。
使用‘ggplot2’、‘ggthemes’、‘cowplot’、gridExtra和‘ggpubr’包准备了图形来说明解释变量对代谢物测定值的影响，为了汇总和简化结果，使用ComplexHeatmap和‘circlize’包创建了环形热图，我们使用Inkscape Project完成了图形的最终处理。
研究队列与人口统计学特征 我们的研究队列包括2068只由狗主人报告为健康的狗，该队列包括22个狗品种，边境牧羊犬样本量最大，北博滕斯皮兹样本量最小，狗的年龄从1个月到16岁不等，平均为3.10岁，雌性占总体的54.8％，在采血时84.9％的狗是未绝育的。
广义线性模型我们研究了22个狗品种、年龄、性别、绝育情况、饮食和采血前的禁食时间对119个测定值的影响。这些测定值包括：9个主要氨基酸测定值、1个组合氨基酸测定值、6个氨基酸比例测定值、2个与体液平衡相关的测定值。
5个与糖酵解相关的测定值，1个与炎症相关的测定值、6个胆固醇测定值3个甘油三酯测定值、7个脂肪酸的绝对和相对单位测定值、4个组合脂肪酸的绝对和相对单位测定值、脂肪酸的总浓度。
测定值以及24个高密度脂蛋白、17个低密度脂蛋白和21个超低密度脂蛋白粒子测定值，年龄、性别、绝育、品种、饮食和采血前禁食时间对测定值水平的总体显著性和主要效应。
氨基酸品种对所有氨基酸测定值都有显著影响，而Chihuahua的几个测定值相对较低，观察到最大的品种间差异出现在澳大利亚牧羊犬和Chihuahua之间的酪氨酸浓度中。
年龄对除丙氨酸，支链氨基酸和苯丙氨酸，酪氨酸以外的所有其他氨基酸测定值都有显著影响，而大多数关联是非线性的。
雌性狗的丙氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸支链氨基酸、丙氨酸，缬氨酸、支链氨基酸，酪氨酸和苯丙氨酸，酪氨酸测定值较高，而雄性狗的甘氨酸、酪氨酸和甘氨酸。
支链氨基酸测定值较高，性别和绝育状态对甘氨酸，缬氨酸有显著交互作用，因为未绝育雄性狗的测定值高于未绝育雌性狗和绝育雄性狗，饮食影响除苯丙氨酸，酪氨酸以外的所有其它氨基酸测定值。
个别的支链氨基酸异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，以及总支链氨基酸浓度在生食组中较其他饮食类型的浓度较高，而其他氨基酸测定值中，测定值浓度通常最高的是干食组，禁食时间影响除组氨酸和总支链氨基酸以外的所有其他氨基酸测定值。
灰狗的白蛋白和肌酐水平较高，其中肌酐浓度甚至超过了上限参考值，最大的品种间差异出现在大丹犬和杰克罗素梗的白蛋白以及吉娃娃和灰狗的肌酐之间。
在这两个测定值中，狗的浓度在4到8岁时最高，之后浓度在14岁后甚至降至低于下限RL，白蛋白方面，性别没有差异，但性别和绝育状态对肌酐有影响，绝育雄性狗的浓度较绝育雌性狗和未绝育雄性狗较高。
食用多种食物类型的狗的白蛋白水平较低，而食用生食或生食 干食的狗的白蛋白水平较高，这两个测定值均受到禁食时间的影响。
糖酵解品种影响所有与糖酵解相关的测定值，但品种间差异没有明显的模式，年龄影响柠檬酸、葡萄糖和乙酸水平，葡萄糖水平在幼犬和老年犬中高于成年犬，雌性狗的柠檬酸水平较高，但在其他测定值中没有性别差异。
饮食影响柠檬酸和******酸，食用生食的狗的这两种测定值的水平高于食用其他食物类型的狗，禁食影响柠檬酸、葡萄糖和乙酸，葡萄糖浓度在禁食不足8小时的狗中显著高于禁食8小时或更长时间的狗。
炎症格林蛋白乙酰的浓度最高的犬种是BER、CHI和GR，而GH的浓度最低，接近下限参考范围，雄性的GlycA浓度较高，在8岁以上，GlycA浓度显著增加，甚至在14岁左右超过了上限参考范围，食用干粮的狗的GlycA水平显著高于食用其他食物类型的狗。
胆固醇犬种对所有胆固醇测量值产生了明显的影响，其中肌肉发达且身材纤细的犬种GH、CHI、WH和PRT的浓度最低，而身材较重的犬种BER和GR的浓度最高，所有测量值随年龄增长而增加，特别是在8岁后上升更快。
雌性的所有其他测量值均较高，仅VLDL胆固醇没有性别差异，LDL胆固醇不受饮食影响，但在其他所有测量值中，食用生食的狗的水平较食用干粮的狗低，空腹对VLDL胆固醇的变异有所解释。
参考文献[1] 朱道仙,陆江,卢鹏飞,等.屎肠球菌制剂对老龄宠物犬血脂代谢,抗炎及抗氧化能力的影响[J].黑龙江畜牧兽医, 2020.DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2019.04.0437.
[2] 董士元,刘金果.影响宠物犬免疫效果的因素及改进措施[J].养殖与饲料, 2010, 000(012):3-5.DOI:10.3969/j.issn.1671-427X.2010.12.002.
[3] 吴艳波,李仰锐.影响宠物犬蛋白质需要的因素[J].畜牧兽医科技信息, 2009(10):2.DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2009.10.078.
[4] 郑倩.宠物消费行为及其影响因素研究[J].[2023-09-04].
[5] 范祎立,陈彦宏,路曙菁,等.一种提升宠物犬代谢平衡的膨化粮制备工艺:CN202210434853.0[P].CN202210434853.0[2023-09-04].
[6] 何颖,沈先荣,蒋定文,et al.方格星虫多糖对环境因素复合作用大鼠生物效应及代谢物的影响[C]//全国海洋生物技术与创新药物学术会议.2014.
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