牛钩端螺旋体病，简称勾体病，是由病原性钩端螺旋体引起的人畜共患病和自然疫源性传染病。其主要病理特征：急性为暂短的发热、黄疸和血红素尿；亚急性和慢性为进行性消瘦、贫血、流产和皮肤坏死等。本病在全世界都有分布，几乎所有的温血动物都可感染，家畜中的牛感染率较高。因病原体的血清群和血清型较多又十分复杂，临床症状和病理变化也是多种多样，所以依据临床症状和病毒剖检难于确诊，确诊需进行血清学检验。
发病初期的病牛血清中含有特异性抗体，采用已知抗原检查对此血清中的抗体进行检验，对于早期的病牛诊断极有价值。
一、凝集溶解定性试验
（1）材料准备。抗原为本菌多个（14~19）血清群的标准菌株，分别培养孵育5~7天的生长良好的培养物，每暗视野含菌体50条以上（400倍），运动活泼而且无自凝现象，便可用作抗原。被检血清按常规办法分离的新鲜血清。
（2）操作程序。将被检血清以生理盐水作1:25稀释，加至有机玻璃板的小孔中，每孔加0.l毫升，然后各孔内分别再加标准抗原各0.1毫升。摇匀，置28~30℃温箱内作用3~4小时。由每孔取1滴混合液置玻片上，覆盖盖玻片。在巧150~200倍暗视野显微镜下观察。同时设生理盐水＋抗原的系列对照。
（3）结果判定。在抗原对照（用生理盐水代替被检血清）无误的情况下，被检血清出现凝溶反应的一孔，即为被检血清含有与该孔的抗原相应的抗体，判为阳性。
二、补体结合试验
患钩体病的病牛，其补体结合性抗体，于病后第三天可出现，第四周达到最高峰，抗体可持续1年之久，故可用于诊断。本试验操作方法同于常规补体结合试验。但所用抗原是多种株型的混合抗原，虽然具有属特异性，但不能准确定型，一般多用于流行病学调查。被检血清效价在1:20以上才有诊断意义。当恢复血清效价比急性期增高4倍以上时，具有诊断价值。
三、 间接免疫荧光试验
本方法检出率高达90%以上，具有早期诊断的优点。首先根据各地流行的主要菌型制备抗原片，一般用培养5~7天生长良好的菌液涂片、干燥、火焰固定后，再将用PBS自1:50、1:100、1:200、至1:400等倍比稀释的4个稀释度灭活被检血清分别滴于抗原涂片处。置37℃湿盒内作用30分钟，用pH 7.4 PBS冲洗剩余血清，干后滴加异硫氰酸荧光黄标记的抗体染色30分钟，再用PBS冲去游离染色经镜检，如钩体呈明亮的淡绿色荧光则为阳性。效价≥1:100或双份血清效价增4倍以上则具有诊断依据。
四、酶联免疫吸附试验
本法特异、敏感，其具体做法是：先将钩体抗体与抗抗体分别按ELISA一般方法提取球蛋白，以辣根过氧化物酶标记，然后按下列方法进行染色检查。
（1）直接染色法。先将辣根过氧化物酶标记的钩体抗体球蛋白制剂用生理盐水作1:10稀释后，直接加于用福尔马林固定的钩体涂片，置37℃温盒中染色30~50分钟，水洗两次（约5~10分钟）空气中干燥后，用联苯胺试剂显影（5%乙二胺四乙酸1毫升，饱和氯化铵l毫升，饱和联苯胺溶液9毫升及3%过氧化氢溶液1滴）4~5分钟，水洗，加甘油缓冲液，镜检。
（2）间接染色法。取福尔马林固定的钩体涂片，先加被检血清，即相应菌型抗体（效价1:1000），置37℃湿盒中染色30~50分钟，水洗两次后，再加辣根过氧化物酶标记的抗抗体染色30~50分钟，洗涤干燥后用联苯胺试剂显影，水洗，加甘油缓冲液，镜检。
上述两种染色法，可见钩体均呈棕黄色，即可判定为阳性。
五、 间接红细胞凝集试验
病牛血凝抗体出现较早，具有早期诊断意义。其试验方法和一般间接血凝试验相同。首先提取钩体致敏物质，制备醛化致敏红细胞。然后按下述方法进行试验：血清处理，将被检血清0.1毫升加2.5%正常绵羊红细胞液0.4毫升混匀置于37℃水浴中1小时，但要经常摇动，以吸收正常凝集素。离心沉淀后，再取其上清液即1:5倍稀释的血清，用生理盐水按倍比稀释成1:20~1:640，每个稀释度各取0.8毫升，分别加入两孔（一孔对照），在试验孔内各加2.5%致敏红细胞悬液1滴，而对照孔内则加2.5%正常绵羊红细胞1滴，充分摇匀，置于室温或37℃温箱内2小时观察结果。结果判定：以试验组红细胞有引起“＋＋”凝集的最高血清稀释度作为抗体效价。效价1:160以上，或双份血清效价增高4倍以上，可作为临床诊断依据。
六、炭抗原凝集试验
按一般炭凝集试验方法，先将钩端螺旋体超声粉碎制成炭抗原，然后将被检血清56℃30分钟灭活后，用1%正常兔血清盐水稀释成1:2~1:64。各取1滴于玻璃板上。再加炭抗原1滴，摇匀后，于22~37℃静置10分钟。结果判定：能引起“＋＋”凝集最高稀释度为效价终点。1:4以上或双份血清增高4倍以上，判为阳性，但应注意非特异性反应。
作者简介：于翔 兽医师
